薄层色谱定性分析的依据是：在固定的色谱条件下，相同物质的R值相同。常用的定性方法是已知物对照法，即将样品与已知物对照品在同一薄层板上展开，比较组分与对照品的R值。如果二者的R值不同，则组分与对照品不是同一物质；如果二者的R值相同，则不能轻易肯定二者就是同一物质，必须用几种性质不同的展开剂或性质不同的吸附剂展开，若二者的R值都一致，同时又对多种显色剂有相同的反应，这样说组分与对照品为同一物质才比较可靠。也可利用文献R值进行定性鉴别，但是由于薄层色谱的实验条件很难与文献条件完全一致，因此，最好采用相对比移值R进行定性鉴别。
　　对于完全未知的组分，单纯用薄层色谱进行定性分析比较困难，往往需要与其他化学或仪器分析方法相结合。已有薄层色谱—紫外、可见吸收光谱联用(TLC—UV)，薄层色谱—荧光光谱联用(TLC—F)，薄层色谱—红外吸收光谱联用(TLC—IR)和薄层色谱—质谱联用(TLC—MS)等。